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무표지 3차원 단일 세포영상화 기술 : 광회절 토모그래피 (ODT) 현미경 / 세포영상분석실
공초점 레이저 현미경과 같은 형광 이미징 기술은 특정 분자에 결합 된 형광 프로브의 형광을 관찰함으로써 대상 분자나 소기관의 세포 내 공간 분포를 얻을 수 있다. 또한, 살아있는 세포를 이용한 경우에는 동화상으로 기록함으로써, 대상 분자의 시간적 동태에 관한 정보도 정량적이고 정밀도 높게 얻을 수 있다. 따라서 현대 생물학과 기초 의학 분야의 연구에 필수적인 방법 중 하나이다. 한편, Fritz-Zernike에 의해 개발 된 위상차 (phase contrast) 현미경은 일반 광학 현미경에 위상 필터를 추가하고 빛의 간섭 현상을 이용하여 세포의 위상 정보를 밝기 정보로 변환 할 수 있다. 이 기술을 이용하여 염색하지 않고 투명한 세포를 관찰하는 것이 가능해졌지만, 세포나 일부 소기관의 윤곽만을 구분할 수 있고 2차원 이미지만 얻을 수 있는 등의 한계가 있었다. 위의 두 가지 문제를 해결 한 것이 홀로그래피 기술에 의한 정량 위상 이미징 (quantitative phase imaging, QPI)이다. 최근 반도체소자의 기술적 발전에 힘입어 3차원 홀로그래피 기술을 현미경에 채용함으로써, 불균일한 시료에 대해서도 두께뿐만 아니라 시료의 체적이나 굴절률(refractive index, RI)와 같은 정량적 정보도 얻을 수 있게 되었다. 종래의 위상차 현미경이나 미분 간섭 현미경에 비해 시료가 가지는 정량적 파라미터를 끌어낼 수 있기 때문에 QPI라고 불리고 있다.
QPI기법을 실현하는 현미경 장비는 여러 가지 종류가 있지만, 이번에 세포영상분석실에 도입되어 국내에서는 처음으로 분석서비스를 시작하게 되는 현미경 장비는 광회절 토모그래피(optical diffraction tomography, ODT)법에 의한 ODT 현미경 (한국 Tomocube사, HT-2)이다. 원리를 간단히 설명하면, ODT에서는 532nm파장을 가지는 레이저 광을 반도체소자인 디지털 미러 디바이스를 이용해 다양한 각도로 조사함으로써 세포에 대한 201개의 2차원 홀로그램영상을 취득한 후 이들 영상을 모아 3차원의 홀로그래피를 재구성하는 방식이다. 이것은 환상으로 X선 흡수율을 측정하고 3차원 영상을 재구성하는 컴퓨터 단층 촬영 (X선 CT)과 유사하다 (그림 1).
그림 2는 HT-2 현미경의 광학계와 장비특성을 나타낸다. 해당 현미경은 세포 홀로그램을 얻기 위한 참조 레이저 빔 (평면파)을 추가하고, 현미경을 통해 레이저 빔을 고속으로 다양한 각도로 조사하기 위한 디지털 미러 디바이스 장치를 통합했다. 취득한 3차원 홀로그래피 영상에는 세포의 영상에 더하여 부피와 RI 의 정량 정보가 포함되어 있으며, 또한 공초점 현미경에 필적하는 공간 분해능과 약 1초에 단일 세포의 3차원 영상을 재구성할 수 있는 특징도 가진다. 형광 수식에 의한 공초점 현미경의 세포 관찰에서는 형광 퇴색 (광독성)과 레이저 스캔 속도의 한계와 같은 단점이 있지만, ODT는 비침습적이므로 이러한 한계를 극복할 수 있다. 그에 비해 ODT에서는 형광 수식을 사용하지 않기 때문에 특정 분자의 분포에 대해 조사할 수 없고, 주위와의 굴절률의 차이가 크지 않으면, 소기관 윤곽의 명확한 화상을 재구성하는 것은 어렵다. 또한, 취득한 세포의 홀로그래피로부터 정량 정보를 얻기 위해서는, 세포를 둘러싸고 있는 배지의 굴절률을 미리 측정해 둘 필요가 있다. 도입된 이번 장비에는 이러한 양쪽의 장단점을 보완하기 위해서 형광관측도 가능한 모듈이 포함되어 있어 기존의 2차원 형광 관찰과 함께 3차원 ODT분석을 수행할 수도 있다.
국내 벤쳐 기업에서 개발된 ODT장비는 개발 초기부터 적혈구에 기반한 질환진단에 응용되어 왔지만, 세포소기관 관찰 등 세포 내에서 발생하는 다양한 생명현상에 적용될 수 도 있다. 지금까지 세포영상분석실에서는 국내에서는 처음으로 ODT를 이용하여 줄기세포 내에 존재하는 소포에 대한 분석에 성공하였고, 최근에는 호산구 내 고밀도 과립을 정량할 수 있는 기술적 기반도 확립하였다 (그림 3). 서울아산병원에 존재하는 다양한 생검용 샘플에 적용할 수 있기 때문에 앞으로 줄기세포치료, 바이러스 감염, 호산구 증가증 관련 질환 등 다양한 질환과 관련된 세포 특성연구와 세포에 기반한 진단 및 약물유효성평가 기술 개발에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
[ 파이펫 ] 일정 체적의 액체 또는 기체를 측정하거나, 다른 용기에 추가하거나 할 수 있는 기구
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